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doi: 10.14218/MRP.2019.071
Published online: December 25, 2019
先简要介绍几个概念。
免疫组化最常用的是DAB（二氨基联苯胺）染色法，其检测原理主要是首先通过酶标羊抗小鼠/兔IgG聚合物识别连接在组织切片上的一抗，再加入DAB染色液后，聚合物上的辣根过氧化物酶可以催化DAB中的H2O2分解，使联苯胺氧化成联苯亚胺，从而使组织切片中一抗结合的抗原位点出现黄色或黄棕色。此外，还需要用苏木素将组织切片细胞核复染成蓝色。
免疫组化图片数据可以使用图像分析软件进行定量分析。累积光密度（IOD），就是把图片上每个棕色点的光密度值全部累加起来得到的值。平均光密度（Mean density）就是用IOD除以有效目标分布区域的面积（area）所得到的值。免疫组化照片主要是比较组别间平均光密度的大小。今天给大家介绍最常用的图像分析软件：ImagePro Plus的基本使用方法。
（1）点击file-open，打开一张图片，然后点击：measure -carliberation- intensity，调出intensity校正窗口。
（2）在窗口里点new,新建一个caliberation set，然后选择std option density，这时窗口中的直线变成了反向的曲线。
（3）定白点，扣除背景。点option，在弹出的小窗口里设置black level为0，点image按钮，然后在图片上各个最白的地方点一下，在其显示的数值中选择一个差不多的整数，比如230，或220。最后在incident level中把默认的255改为230或220。点击OK。
（4）点击右上角的systerm按钮，最后点击close关闭窗口。设置后测量的光密度值与样品浓度呈正比关系。
点击process，在segmentation中点击右上角的下拉菜单，选择使用HSI颜色系统，H 为色调，S 为色饱和度，I 为强度。设置H:0-30、S:0-255、I:0-230，然后点file-save file。默认的保存文件名是rgb24.rge。注意HSI的选择范围是根据图片情况调整。
（1）点击measure，选择count/size，点击select measurement。一般选择IOD和默认的area进行测量。（area的过滤值，默认为10，可以设置到25-50，去掉小的杂点）
（2）点击option，outline下拉选择filled，label style下拉选择none，smoothing设置1，其他的不选。点击OK。
（3）在count/size窗口中点file--file save settings。保存环境设置文件。
（1）用irregular工具画出测量区域。
这里需要区别是否要圈定测量区域：当测量整张照片的光密度时，就不必画测量区域。如果照片有些地方需要剔除，例如有个角正处于切片边缘，没有细胞，需要把这个角上的空白面积扣掉，此时画的“测量区域”就应该沿着样品的边缘来画。
（2）点击count按纽。测量数据在view statistics窗口中，读取IOD SUM数值，作为这张照片的累积光密度值。
（1）测量每张照片的IOD SUM，如果有选定测量区域，还需测量area。平均光密度，反映了这张照片上免疫反应物的表达强度。mean density = (IOD SUM)/area, mean density 和 IOD 都是个相对值，所以是没有单位的。
首先分别测量出每组中每个样品几张照片的mean density，然后算出平均值作为这个样品的mean density。一个实验组的几个样品测量值可以计算其平均值与标准差，最后用这个平均值来统计各组间的差异。
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