一、锌指核酸内切酶（zinc-finger nucleases，ZNF）

在哺乳动物细胞中，双链DNA断裂后通过同源介导的修复（homology directed repair, HDR）或者非同源末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）来修复损伤部位，两者发生的概率比约为9:13。目前为止，科学家发现，在果蝇、植物、线虫以及哺乳动物细胞中，位点特异性的锌指核酸内切酶能够造成双链DNA断裂，并最终通过同源重组或者非同源末端连接获得目的基因突变体。

锌指最开始是在Xenopus中发现的在Mtazoa中最常见的DNA结合基序。每一个指状蛋白能够通过α螺旋识别3-4对DNA碱基对，因此，多个指状结构可以随机连接起来从而高度特异性地识别大量不同的DNA序列。Chandrasegaran实验室研究发现，由锌指蛋白DNA结合结构域（此区域特异性地结合在DNA目的区域）以及TypeⅡS限制性内切酶的非特异性剪切结构域FokⅠ融合可以形成锌指核酸内切酶。锌指核酸内切酶FokⅠ结构域的二聚化为DNA结合结构域发挥功能所必须，因此在通过锌指核酸内切酶构建稳定敲除的突变体的过程中，需要设计成对的锌指核酸内切酶用于精准地靶定在特异的目的基因序列实现锌指核酸内切酶的二聚化以及DNA剪切。其具体过程为：通过在细胞内瞬时表达锌指核酸内切酶，其靶定在目的基因特异性位点并产生双链DNA断裂缺口，进而通过细胞内同源重组修复损伤部位进行基因敲除。

相比于非定点突变，锌指蛋白核酸内切酶具有显著优点：

• 高度特异性：通过随机连接锌指蛋白决定着锌指蛋白核酸内切酶特异性识别的DNA序列，即：成对的锌指蛋白核酸内切酶根据DNA的方位和空间精确地定位在同一个DNA区域，从而产生一个双链DNA缺口。

• Fyodor D. Urnov等发现，锌指蛋白核酸内切酶诱导的在遗传病突变热点处发生双链DNA损伤并且通过同源重组获得永久精确改变的效率高达20%。

高的同源重组效率以及锌指核酸内切酶特异性识别目的基因的特征使得锌指蛋白核酸内切酶介导的基因编辑成为了研究体细胞遗传学的一个有力工具，科学家也一度认为其可能是人类遗传病基因修正治疗的潜在手段：

• 锌指蛋白核酸内切酶介导的基因组敲除在生命科学，生物技术以及医学领域将得到广泛应用。科学家可以利用其敲除目的基因从而研究其在生物体中的具体功能；

• 锌指蛋白核酸内切酶介导的基因组敲除可以帮助科研工作者选择性地删除内含子等非编码的基因结构，从而更为精确地定位其生物学功能；

• 锌指蛋白核酸内切酶介导的基因组敲除可以显著促进干细胞研究以及基因治疗。医学工作者提出假说：基因突变引发的遗传病可以通过选择性删除干细胞或者体细胞中突变基因来实现基因治疗的效果。

虽然通过编码锌指蛋白核酸内切酶介导的技术，科学家获得了多种目的基因敲除的生物体和细胞系，但是其也存在许多缺陷：

• 为了删除目的基因，科学家必须在目的基因的编码区而不是非编码区寻找潜在的锌指蛋白核酸内切酶靶定位点，即：并非所有的潜在区域都是锌指蛋白核酸内切酶理想的靶定位点；

• 获得识别特异性区域的“锌指蛋白装配模块”效率低于6%，即：并非所有的锌指结构都可以有效的、可靠的组成锌指蛋白核酸内切酶，并且某些装配的锌指蛋白核酸内切酶具有细胞毒性，从而限制了对某些特定基因的敲除效果；

• 脱靶效应。由于在细胞内表达的锌指蛋白核酸内切酶单体可能出现同源或者异源二聚化，因此很容易造成成对的锌指蛋白核酸内切酶并没有特异性靶定到目的基因序列；

• 编码锌指蛋白核酸内切酶以及其DNA分子导入细胞中的方式有限；

• 锌指蛋白核酸内切酶自身的免疫原性使得其在临床治疗中需要考虑其会引起的机体免疫反应；

• 目的基因删除的单克隆筛选繁复。

二、TALEN（transcription activator-like effector nucleases）

转录激活子样效应因子（transcription activator-like effector，TALE）是由植物病原体Xanthomonas spp衍生出的一类病毒因子家族，当这种病原体被注入到宿主植物时，其将结合至宿主启动子的特定区域从而调控植物疾病发生的进程。TALEs由17-18个重复序列紧密排列组成，每个重复序列含有34个氨基酸，目前研究表明，每个重复序列中第12,13位氨基酸与其DNA结合特异性有关，与锌指蛋白单个模块识别3-4个碱基不同的是，TALEs的每一个氨基酸只对应地识别单个碱基，这一方面意味着在识别相同基因序列的前提下，TALEs需要3倍锌指蛋白模块数，但在另一方面也意味着，TALEs在特异性识别目的基因序列的过程中更加灵活。因为每个锌指蛋白单个模块特异性识别3-4个碱基，也就意味着需要从100多种模块挑选组装特异性的锌指蛋白核酸内切酶，此外每个模块自身以及模块之间的连接顺序都会显著影响锌指蛋白核酸内切酶结合及切割目的基因的效率。正如Martin Luther University的Jens Boch所说的那样：“TALEs很神奇，当我们知道不同TALEs重复序列的氨基酸组成，就可以预测它会结合至某个特定的DNA序列，也就是说敲除的目的基因序列决定我们设计不同的TALEs，而锌指蛋白在某种程度上决定我们对目的基因区域的选择。”

目前为止，酵母、植物、石斑鱼以及人类细胞系中DNA都能通过设计相应的TALEs来靶定，研究人员通过结合TALEs和限制性核酸酶来编辑基因。如前面我们提到的，与锌指核酸内切酶介导的基因敲除相比，TALEN介导的基因敲除在针对不同目的基因设计转录激活子样效应因子模块时更加灵活，从而大大缩短了目的基因敲除的时间和花费。此外，我们提到锌指核酸内切酶存在脱靶效应以及细胞毒性，其脱靶效应主要与锌指蛋白DNA结合结构域非特异性结合以及FokⅠ核酸酶二聚化有关，而TALEN也使用FokⅠ核酸酶，从而也具有脱靶效应。但是，研究表明其脱靶效应以及细胞毒性明显要低于锌指核酸内切酶。虽然如此，TALEN介导的基因敲除也存在一些明显缺陷：

• 目前为止，虽然利用TALEN技术，很多公司和研究机构成功构建了多个目的基因敲除的小鼠等动物模型，但科学家对其背景缺乏基本了解，这就造成当构建的TALEN没有按研究者计划敲除目的基因时，研究者往往不知道从哪处着手解决问题。

• 与在自然界广泛存在的锌指蛋白相比，TALEs仅在植物病原体中发现。因此，理论上，相对于前者来说，后者会是一种更强的免疫原。

三、CRISPR/Cas9系统

虽然锌指蛋白核酸内切酶、TALEN介导的基因编辑在生物学领域被深入研究和应用几十年，但是鉴于其存在的缺点，一种更易评估、负担及获得的新的基因编辑技术仍是科研以及临床应用的需求。基于Ⅱ型原核CRISPR适应性免疫系统来源的RNA引导的Cas9核酸内切酶对基因组的精确编辑使得科学家在基因编辑领域取得了惊人的进步。

CRISPR-Cas最初被发现是因为它作为细菌的适应性免疫系统，利用RNA引导的核酸酶来剪切外来的基因元件。目前为止，在细菌和古生物中一共发现了三类CRISPR系统，它们都由Cas基因、非编码RNA和一个特殊的重复元件构成的CRISPR RNA（crRNA）阵列组成。例如，Ⅱ型CRISPR系统包含核酸酶Cas9、编码引导RNA的crRNA、以及激活tracrRNA，后者可以将crRNA加工成独立的含有20个核苷酸的小单元，即引导RNA（guided RNA），引导RNA通过Watson-Crick碱基配对法则引导核酸酶Cas9结合至目的基因序列从而造成目的基因双链DNA断裂，被剪切的目的基因通过同源介导的修复或者非同源末端连接来修复损伤部位。

在利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑时， crRNA和tracrRNA可以融合成单段引导RNA （single-guide RNA, sgRNA），通过改变sgRNA 20个核苷酸的序列，Cas9可以被引导至不同目的基因的序列从而编辑不同的目的基因。此外，利用CRISPR/Cas9系统已经在不同的生物体和细胞系中成功进行了基因编辑，在这个过程中，为了保证基因编辑的最大成功率，通常要根据物种的不同，对Cas9要进行优化。

同锌指蛋白核酸内切酶以及TALEN相比，CRISPR/Cas9系统因其更简单的操作，被科学家认为具有更加广阔的应用前景：

• CRISPR/Cas9系统通过特异性设计针对目的基因序列20个核苷酸大小的引物，可以将Cas9特异性地引导至目的基因序列，在操作时间上大大缩短。设计针对靶基因的引物大约就花费1-2周时间，而目的基因敲除的细胞系在2-3周内即可获得；

• 位点切割更具有特异性。Cas9稳定地在靶序列第17,18个碱基处切割目的基因；

• 编辑效率更高。Cas9和TALEN都可以在不同的细胞系和生物体中有效编辑基因组，但是由于Cas9相比于TALEN更容易靶定至目的序列，这意味着利用CRISPR/Cas9系统可以通过设计针对多个目的基因的sgRNA在一个细胞系中同时进行多个目的基因的编辑。

但是，同锌指蛋白核酸内切酶以及TALEN的缺陷一样，CRISPR/Cas9系统也存在脱靶效应。目前为止，科研工作者对其主要缺点的解决办法是，通过生物信息学预测出多个容易脱靶的潜在位点，从而在sgRNA设计过程中避开这些潜在脱靶位点。

四、NgAgo-gDNA基因编辑技术

2016年5月2日，河北科技大学韩春雨课题组在顶尖杂志《Nature biotechnology》发表了自己具有极大原始创新性的生物技术领域研究成果，称其发现了一种由NgAgo (Natronobacterium gregoryi Argonaute)介导的新的基因编辑技术，与时兴的CRISPR/Cas9系统利用gRNA引导Cas9至靶定区域不同的是，其利用引导DNA（gDNA）引导核酸内切酶NgAgo至目的序列。虽然该技术后来遭到许多科学家对于其可重复性的质疑，韩春雨于2017年1月又向《自然•生物技术》杂志提交了与NgAgo系统可重复性相关的最新数据，目前《自然•生物技术》仍在对这些数据进行调查研究。这里我们不论事件的背景隐情及最终结论如何，仅针对这个技术进行描述和比较。

Argonaute家族具有核酸内切酶活性，以前对此家族的研究发现其能有效利用5’磷酸化的ssDNA作为介质，精确切割靶基因，然而从 Thermus thermophilus 以及 Pyrococcus furiosus 中分离的Argonaute在65℃反应温度时才能发挥最大活性，因此限制了其作为工具在哺乳动物中进行基因编辑的的应用。韩春雨课题组利用从 Natronobacterium gregoryi 分离出的Argonaute发现，NgAgo能够在37℃同5’磷酸化的ssDNA结合，对目的基因进行剪切。

NgAgo-gDNA基因编辑技术的应用方法同CRISPR/Cas9系统类似，即：设计合成一对针对目的基因的、互补的、长度为24个碱基的5’磷酸化的ssDNA作为引导DNA，引导核酸内切酶NgAgo靶定到目的基因部位并制造双链DNA缺口，然后通过细胞内同源重组进行DNA修复。

虽然该文作者发现，NgAgo-gDNA介导的基因敲除同CRISPR/Cas9系统的效率不相上下，但是目前的研究结果表明，前者在预防脱靶效应以及应用方面可能优于后者：

• 碱基错配对NgAgo效率影响巨大。当gDNA同目的基因有一个碱基错配时，内切酶NgAgo效率降低73%-100%；而当出现三个碱基错配时，NgAgo效率几乎完全消失；而在CRISPR/Cas9系统中，其可以容忍5个碱基的错配；

• 自然条件下，Argonaute在多个生物体中都存在，其引导DNA即5’磷酸化的ssDNA在哺乳动物中含量少，并且NgAgo同5’磷酸化的ssDNA结合是快速专一的；

• 在CRISPR/Cas9系统中，穿插在crRNA重复序列的前间区序列周围保守的前间区序列临近基序（protospacer adjacent motif, PAM）对gRNA在靶基因的定位有较大影响，而在NgAgo-gDNA中并没有这个限制。

在本文，我们对基因敲除技术的发展做了一个简单的梳理。总之，相较于非定点突变，锌指蛋白核酸内切酶因为首次能够特异性地敲除目的基因，在发现的几十年的时间里，科学家投入了大量的时间和金钱进行研究优化其条件；而TALEN技术的出现，极大改善了系统中DNA结合模块的灵活性，因此逐渐取代了前者，而在TALEN技术还没有被完全了解其背景时，CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除技术几乎成为了基因编辑的主流。因为其更加高效、耗时短、易操作，目前为止，已经有科研团队利用其在人类胚胎中进行了基因改造，故其在科研、临床疾病治疗的方面一度被看好；而NgAgo-gDNA系统，目前为止，其呈现出同CRISPR/Cas9系统相似的高效率，并且在应用方面更加简单，脱靶效率更低，但是其后续是否能够取代CRISPR/Cas9成为一种能应用于科研及临床上的最成熟的基因编辑工具还有待科学家们进一步研究和证实。