2018年1月，从部队退役的我来到内蒙古医科大学附属医院工作，开启了一段新的人生旅程。虽然参加工作已十年有余，但来到陌生的医院，面对陌生的同事，还是难免紧张与惆怅。经历了新入职三个月左右的阵痛期后，我就开始逐步思考如何在新单位开展科研。我的目标很明确，就是通过三年左右的积累，形成自成体系的、内容聚焦的研究方向，同时组建高产的科研团队。毕竟，科研不仅仅是我的爱好，也是我安身立命的技能之一。
2010年前后，我曾阅读了首都医科大学朝阳医院施焕中教授撰写的大量博文。施教授的博文中既有充满睿智的学术短评也有感叹世事无常的闲情小记，其内容之精妙，常令我拍案叫绝。施教授主要从事胸腔积液基础与临床研究，发表过很多高水平的学术论文。从他那些深邃的学术短评中，我逐渐对胸腔积液领域的研究现状有了一定的了解，同时也对胸腔积液生物标志物产生了浓厚的兴趣。
那段时间，我还阅读了很多关于PRIDE研究的文章，并且应邀在AME出版社的官方订阅号“科研时间”上发表了一篇题为《为什么599个病例就能发二十几篇SCI论文：深度剖析PRIDE研究》的推文。PRIDE研究是麻省总医院的Januzzi JL等人开展的一项观察性研究，旨在评价血清生物标志物在急诊呼吸困难人群中的诊断和预后评估价值。研究者募集了599名因呼吸困难而就诊于急诊科的患者，记录了这些患者的诊疗过程，收集了这些患者的基线血清。随后，研究者利用所获取的临床资料和血清标本，系统阐述了多个血清生物标志物（NT-proBNP、MR-proANP、sST2、galectin-3）在心衰诊断和预后评估中的价值，在J Am Coll Cardiol、Eur Heart J等高水平杂志上发表了多篇影响深远，甚至被写入指南的研究论文。
受PRIDE研究的启发，我计划构建一个不明原因胸腔积液患者队列，并模仿PRIDE研究的思路评价胸腔积液或血清生物标志物在胸腔积液鉴别诊断中的价值。这一研究方向非常契合我当时的实际情况：首先，我是一名检验科医生，开展生物标志物诊断性能评价方面的工作完全符合检验医学的学科发展内涵，对提升我的专业技能有一定帮助。其次，我之前阅读过很多施教授的文章，对胸腔积液生物标志物已经有了一定的了解；第三，在为“科研时间”订阅号撰写有关PRIDE研究的微信推文时，我已经基本摸清了其研究构架、套路和理念，完全可以将那些研究套路“移植”到胸腔积液生物标志物中。对于将来可以采用的研究方案以及具体要研究的标志物，我基本已经做到了胸有成竹；第四，当时我通过朋友介绍认识了呼吸科闫丽医生，经过初步的交流后她愿意帮我募集患者、采集标本、获取患者知情同意书。
我的研究背景以及思路大致是：很多患者因不明原因胸腔积液而到医院就诊。对于这些患者，首要任务是明确胸腔积液的病因，之后才谈得上针对性治疗。胸腔积液的常见病因包括恶性肿瘤、肺炎、心衰和结核等，这些疾病的鉴别诊断手段很多，其中准确性最高的手段就是胸腔镜。然而，胸腔镜为有创检查，容易引发出血、感染等并发症，且在基层医院无法开展。与胸腔镜检查相比，血清和胸腔积液生物标志物在胸腔积液鉴别诊断中同样具有重要的价值。为了探讨胸腔积液或血清生物标志物的诊断价值，我们拟招募一批因胸腔积液就诊且病因不明的患者，在其就诊时采集外周血和胸腔积液标本，并对标本进行分装冻存。尔后，我们则用统一设计的病例报告表格收集患者的数据，包括病史、体征、影像学检查结果、实验室检查、病理学特征、治疗反应性等重要临床特征以及最终诊断。有了这些数据，我们就可以分析胸腔积液或血清标本中的生物标志物对各种类型胸腔积液的鉴别诊断价值（图1）。比如，当我们想分析sFasL对结核性胸腔积液的诊断价值时，我们就可以根据最终诊断将患者分为结核性胸腔积液和非结核性胸腔积液，同时采用ELISA或其他方法检测胸腔积液中的sFasL，然后采用受试者工作特征（ROC）曲线等方法分析sFasL对结核性胸腔积液的诊断价值，或者比较多个生物标志物的诊断性能。
2018年5月，我开始按部就班地准备开展胸腔积液生物标志物研究，包括伦理申报、研究注册等。2018年6月，我们的研究内容顺理成章地获得了伦理委员会的批准。紧接着，我就开始在中国临床试验注册中心注册自己的研究。我辗转反侧、冥思苦想了好几个晚上，最终将我们的这个研究命名为SIMPLE研究，即A Study Investigating Markers in PLeural Effusion。SIMPLE这个名字恰好符合我们做科研的理念：科研的真谛就是用简单的手段解决复杂的问题，而不是为了秀技术而将简单的问题复杂化。
按照理论申报书以及注册网站上的研究计划，我们于2018年9月开始招募患者。同年10月，我将SIMPLE研究的protocol投给了BMJ Open。在经历了两次修改后，该protocol于2019年8月顺利发表，吹响了SIMPLE研究前进的号角[1]。
在SIMPLE研究有序推进的过程中，我有幸认识了很多志同道合的朋友，比如科室的郑文琪博士、胸外科张满博士和基础医学院温建勋博士等。大家逐渐开始组团前行，一起开展胸腔积液方面的研究。2020年前后，常熟市第二人民医院的蒋廷旺教授听说了我的SIMPLE研究后，表示愿意和我合作构建队列，开展胸腔积液生物标志物方面的研究。在获得了伦理批准后，蒋教授也开始在常熟募集胸腔积液患者。这样一来，我们的SIMPLE研究就成了双中心设计，研究人群的代表性也得到了增强。2020年，我被聘为硕士生导师，研究团队进一步壮大。
2018年至2021年期间，由于研究队列的募集工作尚未完成，我们团队也拿不出漂亮的数据来撰写论文，因此只能发表一些胸腔积液方面的综述和meta分析[2-12]。这些综述和meta分析有两点意义：一是让团队成员感受到这个研究方向是有奔头的，从而愿意投入更多的精力；二是让我们进一步熟悉胸腔积液领域的研究现状，便于我们将来选择合适的研究切入点。比如，我们在阅读文献的过程中发现多个研究探讨了血清乳酸脱氢酶（LDH）与胸腔积液腺苷脱氨酶（ADA）的比值（俗称癌症比值，CR）对于恶性胸腔积液的诊断价值，就顺手做了一个meta分析[12]。在做meta分析的过程中，我们发现血清LDH和胸腔积液ADA均受年龄影响，但尚无研究探讨年龄是否会影响CR对恶性胸腔积液的诊断价值，这就为我们后期研究年龄影响CR的诊断性能埋下了伏笔[13]。
2021年8月，SIMPLE研究的队列人群招募工作结束。呼和浩特队列总共募集到170名患者，常熟队列总共募集到62名患者。这些患者的临床特征均已详细记录在了病例报告表格中，多数患者的诊断十分明确。更重要的是，这些患者的胸腔积液和血清标本均已分装冻存于10个EP管中，这为我们后续研究胸腔积液和血清生物标志物提供了坚实的保障。
队列募集工作和数据整理工作完成后，我们就从冰箱中取出一管胸腔积液，把检验科能检测的常规生化项目几乎都检测了一遍。这样我们就可以探索多个生物标志物在胸腔积液鉴别诊断中的价值了。利用这些常规检验数据，我们先后分析了人附睾蛋白4（HE4）[14]、CA72-4[15]、CA50[16]、proGRP[17]、同型半胱氨酸[18]等肿瘤标志物对恶性胸腔积液的诊断价值。针对一些无法在检验科检测但极具研究价值的标志物，我们还购置了ELISA试剂盒进行检测。课题组利用本不宽裕的科研经费购置了一台酶标仪，检测了胸腔积液sFasL、CXCL9、CXCL11等生物标志物，并对这些生物标志物对结核性胸腔积液的诊断价值进行了评价，研究结果发表在了Cytokine、J Thorac Dis上[19,20]。上述研究在本质上属于跟踪创新，也就是去验证前人的发现。此类研究的套路相对成熟和固定，一般就是先根据金标准将患者分为两组，比较两组患者血清或胸水生物标志物浓度的差异，采用ROC曲线分析生物标志物的诊断性能，采用决策曲线分析（DCA）研究生物标志物所能带来的净受益。
我们还分析了年龄、肾功能等因素对生物标志物诊断性能的影响，比如：年龄对CR诊断恶性胸腔积液性能的影响[13]、对血清NT-proBNP诊断心源性胸腔积液性能的影响[21]、对ADA诊断结核性胸腔积液性能的影响等[22]。这些研究的基本套路都是一样的，就是按照年龄对患者进行分组，比较生物标志物在各组受试对象中的曲线下面积（AUC）。同时，采用我们自创的“限制纳入标准上限后重采样”的统计学方法，分析年龄对生物标志物诊断性能的影响。这一方法的统计学原理可以参阅我们此前发表的论文[21]。
那篇年龄影响ADA诊断结核性胸腔积液的文章纯属一个意外收获[22]。按理说ADA诊断结核性胸腔积液是一个已经写入教科书的话题，并不太可能发表在严肃的学术杂志上。可是我们却运气爆棚地将论文发表到了检验医学领域的标杆杂志Clin Chem Lab Med上。事情的经过大约是这样的：我们课题组在分析胸腔积液LDH与ADA比值诊断结核性胸腔积液的过程中，发现ADA的AUC仅为0.80左右，与此前研究的结果相去甚远[23]。当时我们还以为数据弄错了，经过反复核实确认数据无误后才敢把论文投出去。我们仔细分析了既往发表的论文，发现他们都有一个特点，就是结核性胸腔积液患者的平均年龄在40岁左右，而非结核性胸腔积液患者的年龄多在60岁左右。但是在我们的研究中，结核性和非结核性胸腔积液患者的平均年龄都在70岁左右。因此，我们推测研究对象年龄上的差异可能是我们的研究与既往研究结果不一致的原因。为了验证这一推测，我们采用了前述的“限制年龄上限进行重采样”的方法探讨年龄对ADA诊断性能的影响，结果确实证实年龄越大，ADA诊断性能越低。同时，我们还对既往的研究进行了分析，探讨了非结核性胸腔积液患者与结核性胸腔积液患者的平均年龄差与ADA的AUC之间的关系，发现二者居然呈正相关。这一结果也进一步证实：年龄是我们的研究与既往研究结果不一致的因素之一。因此，在对胸腔积液ADA的诊断价值进行解释时，需要考虑年龄这一因素。
我们给这篇论文起了个非常吸引眼球的标题：Diagnostic accuracy of adenosine deaminase for tuberculous pleural effusion: age does matter。抱着试一试的心态，我们将论文投给了JAMA Network Open，但却出乎意料地收到了编辑部的修改意见，这极大地增强了我们的信心，因为我们深知JAMA Network Open的分量。我们不敢怠慢，按照审稿人的要求认真修回了稿件，心中窃喜：论文应该会被接受。然而，天有不测风云，人有旦夕祸福。JAMA Network Open的编辑又邀请了新的审稿专家来评审我们的稿件。新的审稿专家对我们的稿件并不友好，虽然没有指出文章的任何硬伤，但是坚持认为文章的创新性、影响力和读者群体达不到杂志的发表要求。最终，编辑根据审稿人的意见拒绝了我们的稿件。没办法，ADA诊断结核性胸腔积液这种老掉牙的话题显然提不起JAMA子刊的兴趣。后来，我们将稿件投给了Clin Chem Lab Med，小修后顺利接受[22]。
我们在阅读文献撰写综述的过程中，发现很多研究提到了采用生物标志物的比值来鉴别诊断胸腔积液，比如采用LDH/ADA比值来诊断结核性胸腔积液，采用胸腔积液和血清CEA比值来诊断恶性胸腔积液等。我们在总结这方面的文献时，发现他们都忽略了一个关键的问题，就是未分析标志物的比值是否比单个标志物更具有优势。比如胸腔积液ADA本身就是诊断结核性胸腔积液的优秀标志物，在其基础上加上一个胸腔积液LDH，形成一个新的参数叫LDH/ADA，尽管这一参数对结核性胸腔积液也有诊断价值，但是如果LDH/ADA的诊断价值和ADA相当，那它就是毫无意义的。换而言之，生物标志物的比值必须在单个生物标志物的基础上有所提升，否则将毫无意义。根据这一思路，我们利用SIMPLE队列的数据，外加一个回顾性队列（BUFF研究），先后证实了胸腔积液LDH/ADA比值对诊断结核性胸腔积液的意义不大[23]、胸腔积液与血清CEA比值对恶性胸腔积液的诊断价值同样不高[24]。
我本人是检验科医生，对于分析前质量控制较为敏感。我发现国际上有好几个和我们一样的不明原因胸腔积液队列，大家在评价胸腔积液生物标志物时用的都是经过-80度冷冻的胸腔积液标本，但大家似乎都没有关注过长时间冷冻是否会影响胸水生物标志物的稳定性。很明显的一个问题是：如果长时间冷冻会影响胸水生物标志物的稳定性，那这就意味着我们在论文上看见的结果并非真实世界的结果，这些论文的结论的可推广性也就值得商榷了。在我们医院，几乎所有胸腔积液患者在入院时都会常规进行胸腔积液CEA的检测，而我们刚好有冷冻了三年左右的胸腔积液标本的CEA结果，这就为我们研究CEA在长期冷冻下的稳定性提供了契机。我们采用Bland-Altman分析、Passing-Bablock回归、Deming回归等统计学方法，确定了CEA在冷冻三年左右的胸腔积液标本中是相对稳定的[25]。ROC分析结果也表明，冷冻标本CEA和新鲜标本CEA的AUC是相似的。这就充分说明了：-80度冷冻并不会影响CEA的稳定性，也不会影响其诊断性能[25]。于是我们得出结论：-80度冷冻对生物标志物稳定的影响不大（至少对CEA是这样），此前的研究结论应该是可以推广的。
截至2024年8月，我们课题组利用SIMPLE研究的标本和临床资料，先后在Thorac Cancer、Transl Lung Cancer Res、Ther Adv Respir Dis、Clin Biochem、J Thorac Dis、BMC Pulm Med、Cytokine、Clin Chem Lab Med等杂志上发表了多篇胸腔积液生物标志物的研究论文，形成了自成体系的研究成果。这些文章有一个共同特点，就是标题中都会包含pleural effusion这个单词。因此我们在申报相关课题的时候，总会在论文清单里面将pleural effusion这个单词进行加粗，以凸显我们在这个领域已经有了厚实的积累。